Aujourd'hui, parlons du problème qui a causé d'innombrables collègues de recherche - Expérience Western blot (WB). Cette expérience apparemment simple mais pleine d'expérience des "pièges", pourquoi cela nous fait-il toujours trébucher encore et encore? Voyons maintenant les raisons des échecs ensemble.
I. Pas de bandes
Les raisons possibles peuvent inclure:
- Problèmes d'anticorps: L'anticorps peut être inefficace, non spécifique ou ne se liant pas à la protéine cible.
- Problèmes d'échantillonnage: L'échantillon peut contenir des substances interférentes, être trop faible en concentration ou déjà dégradé.
- Problèmes d'électrophorèse: conditions d'électrophorèse inappropriées, telles que la tension, le temps ou une mauvaise utilisation du tampon.
- Problèmes de transfert: Problèmes pendant le processus de transfert, tels que la sélection inappropriée de la membrane, le temps de transfert ou le tampon de transfert.
- Problèmes de blocage: la solution de blocage peut être inappropriée ou le temps de blocage peut être trop long.
- Problèmes de coloration: Le réactif de coloration peut être expiré, insensible ou mal utilisé.
Problèmes d'équipement: l'équipement peut dysonner ou ne pas être correctement calibré.
- Problèmes de fonctionnement expérimental: l'opération expérimentale peut ne pas être standardisée, comme un lavage insuffisant ou un chargement d'échantillons inégal.
- Problèmes de modification des protéines: La protéine cible peut subir des modifications post-traductionnelles qui empêchent la reconnaissance des anticorps.
- Problèmes d'expression de la protéine cible: la protéine cible peut avoir une expression très faible ou aucune expression dans les cellules ou les tissus détectés.
Ii Fond élevé
Les raisons possibles peuvent inclure:
- Haute concentration d'anticorps: l'utilisation de trop d'anticorps peut augmenter la liaison non spécifique, entraînant un arrière-plan élevé.
- Problèmes de qualité des anticorps: L'anticorps peut avoir une liaison non spécifique élevée ou une réaction croisée avec d'autres protéines.
- Blocage insuffisant: la solution de blocage ne couvre pas efficacement les sites de liaison non spécifiques sur la membrane, entraînant un fond élevé.
- Problèmes de la membrane: la membrane peut avoir une mauvaise qualité ou une contamination, ce qui conduit à un fond élevé.
- Transfert incomplet: Pendant le processus de transfert, les protéines peuvent ne pas être entièrement transférées sur la membrane, entraînant un fond élevé.
- Lavage insuffisant: les étapes de lavage ne parviennent pas à éliminer efficacement les anticorps non liés ou d'autres impuretés, conduisant à un fond élevé.
- Problèmes de réactif de coloration: le réactif de coloration peut être trop sensible ou instable, ce qui entraîne un fond élevé.
- Problèmes d'équipement expérimental: l'équipement peut avoir des fuites ou des interférences, ce qui entraîne un fond élevé.
- Problèmes d'échantillon de protéines: L'échantillon peut contenir une grande quantité de substances interférentes, telles que les produits de dégradation des protéines ou d'autres impuretés.
- Problèmes de fonctionnement expérimental: l'opération expérimentale peut ne pas être standardisée, comme le temps d'incubation prolongé ou la température élevée.
Iii. Bandes non spécifiques ou tailles de bandes de protéines incorrectes
Les raisons possibles peuvent inclure:
- Trop de passages de cellules, résultant en différents niveaux d'expression des protéines, conduisant à des tailles de bande incohérentes ou à la présence de plusieurs bandes.
- Dégradation des échantillons de protéines, entraînant un poids moléculaire de protéine plus faible ou la présence de plusieurs bandes.
- Les échantillons de protéines exprimés in vivo peuvent avoir diverses formes de modifications telles que l'acétylation, la méthylation, l'alkylation, la phosphorylation et la glycosylation, conduisant à des tailles de bande incohérentes ou à la présence de bandes multiples.
- La protéine cible contient plusieurs isoformes ou variantes d'épissage, entraînant des tailles de bande incohérentes ou la présence de plusieurs bandes.
